Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh
thành cây lai từ tế bào trần là 1 trong những
thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế
bào. Bằng phương pháp này đẻ ra phương pháp
lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện
bằng các phương pháp lai hữu tính thông
thường.
Tế bào trần là những tế bào không có thành tế
bào. Chính vì thế chúng có thể hòa lẫn vào nhau
(dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong
mình vật chất di truyền của cả 2 tế bào.
Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai.
Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế
bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai
soma hay lai vô tính tế bào
Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm
khác nhau của các protoplast thịt lá đối với actinomycin D
Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:
+ Dung hợp bằng hóa chất
+ Dung hợp bằng điện
Dung hợp bằng hóa chất
Xử lý bằng NaNO3
Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3
(0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast.
Carlson và cộng sự (1972) cũng dùng phương
pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên
(Nicotiana glauca × N. langsdorffii). Tuy nhiên,
phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3
không thích hợp với tế bào bị không bào hóa
mạnh như protoplast từ nhu mô lá.
Xử
lý bằng PEG
Thường sử dụng poly ethylenglycol(PEG 5-25%)
là chất có tác dụng dính kết tế bào trần dể dung
hợp chúng. Nồng độ và trọng lượng phân tử của
PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm
dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (~
100) không thể tạo ra một sự dính
chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân
tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn.
Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng
tần số dung hợp và khả năng sống của các
protoplast.
Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu
xảy ra trong môi trường kiềm (pH từ 8- 10) và
khi có bổ sung CaCl2 (50-250 mM).
Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các
protoplast được nuôi cấy theo phương thức
chuẩn.
PEG có 2 tác dụng:
+ Cung cấp một câu nối để Ca2+ có thể liên
kết các bề mặt màng với nhau
+ Dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng
trong suốt quá trình rửa giải.
Dung hợp tế bào trần bằng xử lí PEG
Dung hợp bằng điện
Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và
hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều
quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện
(electrofusion) không gây độc đối với tế bào như
thường thấy ở các protoplast hoặc các thể dị
nhân được xử lý bằng PEG. Người ta đã dùng
các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp
DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật, kỹ thuật
này đã làm tăng sự quan tâm về việc ứng dụng
dung hợp bằng điện vào lĩnh vực di truyền tế
bào soma.
Cách tiến hành
Đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần(2 bản cực
được thiết kế trong các hộp dung hợp), các tế
bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm
giữa 2 bản cực. Khi có 1 xung điện cao (7501000V) trong 1 thời gian rất ngắn(1-200 mili
giây) vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ,
2 tế bào trần hòa nhập vào nhau-quá trình dung
hợp sẽ xảy ra.
7. Triển vọng ứng dụng của kỹ thuật
nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma
Mặc dù những khó khăn về mặt kĩ thuật đã làm hạn
chế tiềm năng sử dụng tế bào trần tuy nhiên tế bào
trần vẫn được ứng dụng trong một số lĩnh vực
nghiên cứu:
Sau khi loại bỏ thành tế bào và được nuôi
cấy trên môi trường thích hợp những tế bào trần
được tái tạo nhanh chóng thành tế bào mới và quá
trình phát triển này đã đưa ra một hệ thông lý
tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào
(Willison và Cocking, Grout 1973)
Các tế bào trần có khả năng tiếp nhận các vật
liệu từ bên ngoài đưa vào trong tế bào do đó tế
bào trần là đối tượng thích hợp cho các nghiên
cứu đưa nhân lạp thể, ti thể,DNA, Plasmit vào tế
bào (Dodds và Bengochea 1985)
Quần thể tế bào trần có thể được xem như một
hệ thống tế bào đơn và bởi vậy các thao tác
tương tự như đối với các vi sinh vật qua đó có
thể lựa chọn dòng đột biến và tách dòng quần
thể tế bào thực vật (Evans và Cocking 1977)
Source: https://sangtaotrongtamtay.vn
Category: Khoa học